新冠病毒檢測爲何出現假陰性?


新冠病毒檢測爲何出現假陰性?

2021-01-12 虎嗅APP

試劑盒檢測結果不僅與試劑盒質量有關,還與新冠病毒自身的特點、採樣部位、採樣量、運輸和儲存環節,以及實驗室檢測條件和人員操作有關。

2020年2月3日,武漢大學中南醫院影像科副主任張笑春發了一條朋友圈:「別迷信核酸檢測了,強烈推薦 CT 影像作爲目前 2019-nCoV 肺炎主要依據」,並稱這是「一個一線影像醫生的大聲疾呼!」

她的言論隨後引發多方關注。

在尚無法準確預測疫情拐點的當下,如果唯一的確診手段無法保證,出現錯檢和漏檢,直接後果將是,很多核酸檢測陰性但仍攜帶病毒的人得不到隔離,他們將成爲新的傳染源。

一個典型的案例是,天津一女性感染病例,1月21日出現發熱後,前後共做了三次核酸檢測均呈陰性,2月1日第四次檢測後才呈陽性。

爲何試劑盒檢測會頻頻出現假陰性?

就此問題,多位專家向《中國新聞周刊》解釋,試劑盒檢測結果不僅與試劑盒質量有關,還與新冠病毒自身的特點、採樣部位、採樣量、運輸和儲存環節,以及實驗室檢測條件和人員操作有關,由多種原因構成,非常複雜,但其中最關鍵的因素,與這次病毒的特殊性有關

每個環節出錯都可能造成結果不準確

一位專門從事核酸檢測的國家某重點實驗室研究員告訴《中國新聞周刊》,由於新冠病毒的特殊性,不同的採樣部位對檢出率有很大影響。

他指出,最好的採樣部位是肺部,因爲這種病毒分布在肺部的濃度最大,但要想采肺泡灌洗液,操作複雜,需要儀器和各種引管,且對人的損傷很大,因此只針對上了呼吸機的重症病人;其次是痰,但這次肺炎不像以往的甲流,很多病患乾咳,無痰。因此,最普遍也最簡單的採樣方式是咽拭子,而咽部的新冠病毒量最少,所以會造成漏檢。

另一位疾控系統內專門研究核酸檢測的專家對《中國新聞周刊》指出,有研究表明,新冠病毒在人的上皮細胞複製非常慢,因此在咽部甚至痰液內,病毒的基數都非常低,加大了檢測的難度。

「有的病人幾次才呈陽性,這是正常的。因爲可能病人前期分泌的病毒量很少,後期隨著病情的發展,病毒增多,才能檢測出來。」前述研究員說。

另外,是否採樣準確、採到了關鍵部位,也會影響採樣結果。以咽拭子爲例,雖然是很簡單的操作,只需要在咽部拿一個棉簽劃一下,但每個醫護人員劃的輕重、多少都不相同。尤其在武漢,在日均檢測量超負荷的狀態下,穿著厚重防護服的醫護人員要實現精準採樣,難度很大。

除了採樣,從樣本運輸到實驗室檢測的諸多環節中,每一個環節出錯都可能造成檢驗結果的不準確。

由於病毒的RNA很容易降解,敏感度很高,送樣過程中必須採取冷鏈運輸,維持在零下20度,一旦凍融超過四次以上,樣本就會受到損傷。此前,首批通過國家藥監局審批的6家新冠病毒試劑盒生產企業之一、上海之江生物科技股份有限公司曾對媒體表示,由於試劑盒要求零下20度的儲存環境,僅少數有冷鏈能力的物流企業可以承運。在運輸過程中稍不注意,有可能就會影響試劑盒最終的檢測結果。

而且,利用試劑盒檢測有很高的門檻,對實驗室的條件也很苛刻。前述研究員告訴《中國新聞周刊》,理論上PCR檢測必須在生物安全防護達到三級的P3實驗室做,但由於疫情原因,爲了短期內快速提高檢測能力,國家將標準放寬,也允許P2實驗室進行檢測。但防護手段要達到P3,比如穿著3級的防護服,檢測人員被要求在生物安全櫃裡進行操作。

他指出,病毒基因擴增非常容易交叉汙染,所以實驗室要分區,提取樣品、發生反應和調配試劑要分別在三個相互獨立的房間,房間之間形成壓差梯度,前一環節房間的壓力要大於後一環節,以保證擴增的分子不倒流。否則試劑容易被汙染,造成假陽性,「這也是實驗室目前最頭疼的一個問題」。

這對檢測人員的操作規範提出了很高的要求。前述疾控系統專家指出,樣本檢測過程中會遇到很多問題,比如有時候擴增曲線沒出來,缺乏經驗的檢測人員很難判斷,是試劑盒質量問題還是操作問題。「這不是一天兩天能培訓出來的,需要積累大量的經驗。」

自1月26日中國疾控中心把檢測權限下放給各地市的三甲醫院後,湖北省共有41家醫院獲得了檢驗資格,目前已經擴展到66家。但一般醫院只有P2實驗室,即便臨時上馬,將防護做到位,專業檢測人員的缺乏仍是個問題。

一份湖北省臨牀檢驗中心官網去年1月發布的消息稱,湖北第十六期PCR實驗室技術人員上崗培訓班的參加人數爲268人,在前年爲220餘人。

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科劉爲勇在接受媒體採訪時坦言,檢驗師要有一定資質和從業經驗,並不是每個人都能做的。「檢驗科的人手不夠,我們還是以前那些人,大概十幾個。除了檢測以外,現在還要手動整理、上報大量患者信息。」

新冠病毒試劑盒生產企業重慶中元匯吉生物技術有限公司的一位技術專家告訴《中國新聞周刊》,目前的檢測模式包括手工監測和全自動儀器檢測兩種。其中,手工檢測要求檢測人員必須具備相關的專業背景,操作還要熟練化,「檢測過程就像看病理切片,短期突擊培訓的人員很難勝任檢測工作」。

據湖北省衛健委主任劉英姿介紹,截至2月4日,整個湖北省能夠提供PCR檢測的實驗室共有97家,包括省市的各級疾控中心18家、66家醫院,以及13家第三方檢測機構,日均檢測量能達到6000人份。

具體到武漢,截至目前,武漢市共有31家機構同時開展核酸檢測,核酸單日樣本檢測能力由最初的200份,提升到每日4000餘份。據武漢市新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控指揮部介紹,武漢核酸檢測的最高能力,目前最高可達到日6000份~8000份。

按照指揮部的部署,要在2月5日至7日兩天內,完成武漢市所有疑似病例的核酸檢測。

在2月6日的湖北省政府新聞發布會上,武漢市衛生健康委主任張紅星表示,目前核酸檢測試劑能滿足需求,但是採樣管、防護設施、採樣人員還有一定缺口。

前述疾控專家指出,目前,無論是試劑盒增產能,還是實驗室布局,檢測的條件已經基本改善了,下一步更關鍵的是,如何嚴格操作,提高實際的檢測能力。

他說:「你把檢測權不斷下放到醫院,要看它有沒有這個條件,具不具備這個能力。不能光把數字上滿足了,但無法滿足真正在一線的需求,產能是否滿足和是否能把病人治好是兩回事。」

CT影像,還是試劑盒檢測?

2月5日,國家衛健委發布《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》。其中最主要的一個變化是,將湖北省和其他省份的診斷分類標準區分開來。

在湖北省,將原本的疑似病例標準拆分,原本的「老三條」:發熱、白細胞或淋巴細胞減少,以及肺部CT影像,被一分爲二,只要滿足前兩條即可視爲「疑似」,相當於放寬了疑似標準。但同時,將第三條肺部CT表現視爲「臨牀診斷」,爲湖北新增的一類診斷類別。確診標準則沒有改變,仍是試劑盒檢測陽性和基因測序與新冠病毒同源。

這爲CT和試劑盒的爭論暫時畫上了句號。張笑春後來發文回應稱,並非否定核酸檢測結果,而是認爲其作爲檢測的最終手段,目前仍受到產量、採樣方式等限制,武漢無法在現階段完全依賴核酸檢測去篩查病人,達到切斷傳染源的防控效果。

可以看出,她此前主張CT檢測,主要是出於防控目的。在那條言辭激烈的朋友圈中,她寫道:「應即刻啓動只要與疑似病例有過接觸者均排查CT,只要CT陽性就近集中隔離於酒店賓館或學校,不能放任無症狀或核酸陰性CT陽性的人家庭留觀。」

但多位專家均對《中國新聞周刊》表示,新冠病毒CT的影像學表現與很多其他病毒性肺炎,如流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒感染等比較類似,很難做鑑別性診斷。因此,目前的技術水平下,最終的確診還是要靠試劑盒核酸檢測。

因此,如何提高試劑盒準確率成爲關鍵。對此,專家建議,除了採樣、運輸和檢測在操作上要儘可能規範以外,還可以採取「雙陽檢測」,也就是用兩家公司的試劑盒進行檢測,或多次檢測,以儘量降低漏檢率。

目前,在一些有條件的醫院,已經開始採取這種更謹慎的檢測辦法。北京某三甲醫院一位發熱門診醫生告訴《中國新聞周刊》,在他們醫院,凡是疑似患者都要進行「雙陽檢測」後才能確診。

一位武漢定點醫院的醫生也表示,爲了提高準確度,醫院會再次確認進行「雙陽檢測」。 據武漢市新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控指揮部最新消息,截至2月5日,武漢各醫院內的疑似病人,第二遍檢測也已全部做完。

應急審批,流程從幾年到幾天

2月3日,工信部黨組成員、總工程師田玉龍在國新辦發布會上表示,截至 2月1日,各家企業的日均試劑盒產能合計達到77.3 萬人份,相當於疑似患者的40倍,而且這還只是「最大產能的百分之六七十」。

多家試劑盒生產企業告訴《中國新聞周刊》,試劑盒供需缺口的很快消弭,得益於國家藥監局迅速推出的「綠色審批通道」。

1月22日,在武漢成立疫情防控指揮部當天,17家企業在國家藥監局的召集下,進行了一場現場應急答辯。此前,他們收到通知,由於新冠肺炎疫情嚴重,一線醫院在短期內需要大量試劑盒進行檢測,國家藥監局決定開啓快速審批通道,特事特辦。

一位當時參與答辯的企業負責人告訴《中國新聞周刊》,雖然通知得很匆忙,但相關的材料仍要準備齊全,和以往申報這類體外診斷試劑時提交的材料類似,主要包括綜述資料、原材料、生產工藝及產品說明、連續3個生產批次的註冊檢驗等。現場有很多專家作爲評委,在企業詳細匯報後進行表決。最終,有7家企業進入了應急審批通道。

1月26日,國家藥監局發布公告,稱4家企業通過了應急審批,整個審批流程僅耗時4天。

此後,又分別於1月28日和1月31日先後共批准6家新型冠狀病毒試劑盒生產企業的產品上市,分別是上海之江、聖湘生物、上海捷諾、上海伯傑醫療、中山大學達安基因以及華大基因。輝睿生物目前仍處於審批中。

這個速度,被前述研究員稱爲「史無前例的快」。他說,以伊波拉病毒爲例,在當時那種緊急狀態下,都是做完臨牀之後一個月才批的。

事實上,新冠病毒試劑盒這種與致病性病原體抗原、抗體以及核酸等檢測相關的試劑,按國家法規,屬於體外診斷試劑的第三類,也就是醫療器械中的最高審查級別,需要由國家食品藥品監督管理總局審查,因此審查程序也繁瑣漫長。

正常情況下,審批至少要2年~3年,不順利的話有時會拖到5年,經常會要求補交各種材料,比如臨牀數據。以前,對試劑盒的穩定性研究就要求至少一年,也就是放置在零下20度的環境內至少一年,實際要放置至少14個月。

國家藥監局的官方通告指出,雖然這次是特事特辦,但按照「統一指揮、早期介入、隨到隨審、科學審批」的原則進行審批,不省流程,不降低標準。

一家首批獲批的企業總經理告訴《中國新聞周刊》,國家藥監局爲每家企業指派兩名審批諮詢老師,雙方共建一個微信羣,在羣內及時溝通審批事宜,幾乎秒回。她還記得一個細節,有一天夜裡三點,對方突然在羣里問,你這個資料準備好了嗎?「他們工作不分晝夜,很辛苦,確實是想要儘快把企業審批出來,」她說。

但前述研究員指出,從幾年縮短到幾天,沒有降低標準是不可能的。據他透露,首批審核的都允許減免臨牀試驗,這在一定程度上降低了試劑盒的質量門檻。但這位研究員也承認,在目前這種應急狀態下,如果照搬老規定,是不行的。

按以前的規定,一個試劑盒產品的申報必須上交三家具有臨牀資質的醫療機構共500人的病歷數據,並有三家單位的簽字蓋章。其中,是否在對這500個病人使用試劑盒之前徵得對方的同意,這涉及到倫理問題,必須把完整的方案遞交所在醫療機構的倫理委員會審核,經審核同意後和病歷數據一起提交。「光倫理這個環節,沒半年下不來的。」他說。

爲了彌補這個漏洞,在首批獲得《醫療器械註冊證》的備註一欄,國家藥監局都註明了:本產品僅爲新冠病毒感染的肺炎的輔助診斷及應急儲備,有效期1年。延續註冊時要補交臨牀數據。以前,這類證件的有效期一般是五年。

正參與第二批評審的深圳普瑞康生物技術有限東莞公司董事長黃高健告訴《中國新聞周刊》,第二批申報中,要求比第一批要高,不能減免臨牀,而要求提交三家機構的數據。但仍比常規要求低,沒有明確要求,這三家醫療機構必須是有臨牀資質的,相當於放寬了臨牀數據獲得的範圍,並且不要求倫理審查。

據他透露,在第二批審核中,國家藥監局把初篩權下放給各省,先由各省藥監局組織初篩,通過後由省里向國家報。整個過程節奏也很快,接到省里通知後第二天就去答辯。目前,他正等待國家的審批結果。

據他了解,第二批申報的企業超過100家,僅廣東省就有近30家。

高產能背後

多位行業內人士向《中國新聞周刊》指出,由於PCR檢測的技術門檻不高,目前全國多家生物技術公司紛紛加入到檢測試劑盒的生產浪潮中,這從第二批申報激增的企業數量就可以看出,對於這個此前較爲小衆的行業而言,新的入局者不斷湧入,其中不乏沒有太多經驗的小企業。

前述研究員指出,目前,各企業正在研發生產的核酸檢測試劑盒基本都採用螢光PCR技術。這個技術早在1983年由美國科學家凱利·穆利斯提出,隨後被應用於病毒檢測、法醫鑑定和考古學等多個領域,後來經過數個版本的優化,技術本身已經非常成熟,也有一套完整的工藝體系。

PCR技術的原理,是將新冠病毒的一段RNA片段逆轉錄成雙鏈DNA,再通過DNA聚合酶進行擴增。原始的病毒遺傳信息極其微量,不易被發現,擴增後更易被識別出來,然後通過一種螢光探針來捕捉,當擴增後的病毒濃度達到一個臨界值時,就會產生螢光信號。這意味著,樣本中被檢測出攜帶新冠病毒。

在此前的伊波拉、甲性H1N1流感和中東呼吸綜合徵等病毒的檢測中,都使用了這種技術。也就是說,試劑盒檢測的方法和技術已經是一套固定的成熟體系,每次只要套用不同的病毒基因就行,技術門檻不高。

因此,在1月10日,國家公布了新冠病毒全基因組序列之後,1月13日至14日,已有多家公司宣稱研發出核酸檢測試劑盒。中元生物在新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的研製只花了兩天的時間,該公司一位負責人對《中國新聞周刊》指出,由於中元生物在體外診斷試劑研發方面多有技術積累,研發新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒就好比「多加一個菜」。

多位受訪的試劑盒生產企業告訴《中國新聞周刊》,他們試劑盒的研製只用了兩三天。

雖然門檻不高,但在前述疾控專家看來,在選取RNA片段、引物和探針的設計、以及一整套工業流程的優化方面,要求企業有至少五年以上的積累和沉澱。否則,雖然基本的技術方法就是PCR,但試劑盒質量仍然良莠不齊。

他指出,衡量試劑盒的質量,主要有三個指標,特異性、靈敏度和重複性。特異性好,就意味著這個試劑盒只能檢測新冠病毒,而不是其他病毒,比如流感或腺病毒。靈敏性高,就會減少漏檢概率,檢出率高。重複性強,則代表穩定性好。因此,三個指標中,最重要的是靈敏度,這也是各種不同試劑盒質量差異的核心所在。

他說,現有這些公司的技術,只要是通過國家藥監局審批,也即在技術標準層面通過其下屬的中國食品藥品檢定研究院檢定的,特異性一般都能保證在99%以上,但靈敏度各家不同。

「中檢院的鑑定保準是一個最低門檻,過了這個門檻上面還有好幾個台階,有的更高一點,有的更低一點。不同的靈敏度,對檢測的準確性影響很大,有的很靈敏,濃度很低的病毒也可以檢測出來,就不會漏檢,有的不太靈敏,就會出現假陰性。」

隨著疫情的發展,對於檢測試劑質量標準的要求不僅僅是快,更要求保證高靈敏度。然而,現實是,相關檢測試劑的研發生產缺乏統一且明確的行業標準。

據中元生物前述技術專家介紹,在診斷試劑行業,行業標準雖然早已存在,但標準對於不同產品中品類的限制並沒有細化。新冠病毒是新近發現的,讓國家去主導做一個新冠肺炎試劑的標準,短期內是不現實的。

在他看來,目前行業內免不了一些企業借著試劑盒的噱頭進行炒作。在此次的疫情防護過程當中,相關檢測試劑廠家的產品之間,質量存在參差不齊的現象。