利用泛基因組方法開發鐮刀菌枯萎病分子標記檢測方法


利用泛基因組方法開發鐮刀菌枯萎病分子標記檢測方法

2021-02-25 百邁客生物

選取63個來自公共資料庫的子囊菌門真菌(包含致病和非致病真菌),其中48個含有基因模型;剩餘的不含基因模型的基因組,需進行基因預測,基因預測採用AUGUSTUS +MAKER 分析方法。

2.2、泛基因組分析篩選Fusarium屬特有的目的基因

利用GET_HOMOLOGUES軟體尋找直系同源基因和旁系同源基因,OrthoMCL軟體對同源基因進行基因家族聚類。根據基因家族聚類結果,尋找只存在於Fusarium 屬的特異基因,以及Fusarium屬內各種間的特異基因。63個子囊菌泛基因組分析共得到685,096個基因,其中子囊菌共有的核心基因有65個。685,096個基因進行基因家族聚類,共得到385,502個基因家族。其中Fusarium屬特有的基因家族2,631個,Fusarium屬內種間特有的基因家族平均爲3,941個。

對上述鑑定到的特有基因(Fusarium屬及Fusarium屬內種間)進一步篩選:1、與GeneBank資料庫中子囊菌門的基因進行比對,過濾掉未知功能的基因;2、同其他物種基因進行比對,過濾掉75%以上相似性的基因。最後得到候選的標記基因集,然後開發用於鑑定Fusarium屬及Fusarium屬內種間的分子標記。

對於Fusarium屬內物種,平均每個物種鑑定到136(SD± 108)個標記基因,而滿足PCR引物設計條件的約爲120對引物對。篩選部分引物進行PCR驗證,見下表。

爲了驗證引物的特異性,選取3種不同來源的DNA進行PCR驗證:1)純培養的子囊菌門不同真菌DNA;2)被Fusarium kuroshium感染的牛油果分離得到的DNA;3)被小蠹蟲(攜帶與其共生的真菌)侵染的樹木分離得到的DNA。挑選Fusarium 屬特異分子標記:FuSp01, FuSp02, and FsuSp03在 F. kuroshium, F. graminearum, F. verticillioides, F. oxysporum, F. tricinctum, F. solani, Alternaria alternata, Botrytis cinerea,  Neofusicoccum parvum進行驗證,其中FuSp02標記具有很強的屬間特異性。

同理挑選Fusarium 種間特異分子標記進行驗證。結果表明F. kuroshium:FuKu01,FuKu02;F. graminearum:FuGr01, FuGr02;F. oxysporum:FuOx01, FuOx02標記具有顯著的種間特異性。