CEX的疏水性影響mAb的聚集


CEX的疏水性影響mAb的聚集

2021-01-14生物抗體

點:將溶液的pH從6.0降低到4.5時,mAb結構穩定性降低

·結合在CEX表面上時,mAb的結構穩定性進一步降低

·CEX樹脂的mAb可及疏水性影響結合的mAb的結構穩定性

·基於螢光的方法用於定量表徵CEX樹脂的疏水性

·總體mAb/樹脂相互作用和固有的樹脂疏水性決定了CEX步驟中的mAb聚集

首先,在CEX上樣條件下,在溶液中研究了mAb的結構穩定性。使用pH值從6.0降至4.5時,使用差示掃描螢光法(DSF),對於mAb1,測得的熔融溫度(Tm DSF(未結合))從60.7降至52.4℃,對於mAb2,從51.5降至45.2℃。然後,在CEX表面上的結合狀態下進一步研究了mAb的結構穩定性。使用差示掃描量熱法(DSC),與相同溶液中未結合的mAb(Tm DSC(未結合))相比,結合的mAb(Tm DSC(結合))的熔融溫度要低4.5-6.5℃。兩種狀態之間的Tm差異(∆Tm DSC(未結合的下限))與CEX操作中mAb聚集的嚴重程度相關,表明固有的mAb穩定性和樹脂性能都非常重要。特別地,顯示出樹脂疏水性具有關鍵影響。這些蛋白質和樹脂相關因子之間的相互作用以及溶液條件最終決定了觀察到的聚集體形成。最後,使用基於螢光的方法測量CEX樹脂的疏水性(Capto SP ImpRes

在強CEX樹脂上,更長的停留時間和更高的溫度會加劇這種聚集體的形成,但是通過在工藝緩衝液中添加精氨酸作爲蛋白質穩定劑,可以有效地緩解該問題。CEX樹脂的總體疏水性是不帶電的,可歸因於多種因素,包括固定相表面的塗層和改性,配體連接體和偶聯化學以及基礎基質的性能。蛋白質和樹脂的疏水性可以使用螢光探針探索,以檢測水性環境中的表面疏水性。廣泛的研究表明,小分子螢光染料,可通過在非極性環境中增加螢光強度來檢測蛋白質的疏水性。爲了進一步改進CEX樹脂的表徵方法,此處使用了不帶電荷的螢光染料身體(4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene),以消除靜電相互作用。在染料和帶負電的CEX配體之間。此外,可商購的BODIPY包含預先設計的連接子,可以連接到大小與典型mAb相似的位阻組分上。由於它們的惰性,穩定的特性和廣泛的應用,本研究選擇了直徑爲15 nm的金納米顆粒(GNP)作爲模擬空間位阻效應的mAb替代品。使用此處開發的GNP-BODIPY方法,通過將結合的mAb分子的結構穩定性與重要的不帶電樹脂特性相關聯,定量確定CEX樹脂的mAb可及的疏水特性,以闡明CEX步驟中的mAb聚集機理。

2 材料 mAb1(IgG1,pI 8.4)(HMW 1.2%),mAb2(IgG4,pI 7.6)(HMW 2.3%)

3 結果與討論

3.1 mAb解決方案的結構穩定性

雖然DSF廣泛應用於mAb製劑篩選,但在這裡用作指導CEX工藝條件(例如上樣,洗滌,洗脫)評估和選擇的篩選工具。Tm DSF(未結合)值的等高線圖如圖1所示。結果顯示,mAb1(IgG1)總體上比mAb2(IgG4)在結構上更穩定,這與這兩種IgG亞型的一般理解非常吻合。基本上垂直的輪廓圖樣表明,在所評估的條件下,pH(在X軸上)對兩種mAb的結構穩定性都具有主要影響,氯化鈉濃度(Y軸)的影響相對較小,且效果顯著主要在0-100 mM的範圍內。事先對洗脫緩衝液(20 mM磷酸鈉,100 mM氯化鈉,pH 8.0,如圖1中的空心圓圈所示)進行了優化,以實現mAb的完全回收(> 95%)。此外,已確認此處使用的洗脫緩衝液對CEX洗脫液中mAb聚集體的形成沒有影響(數據未顯示)。

圖1. pH和氯化鈉濃度對mAb1(A)和mAb2(B)的Tm DSF(未結合)的影響。在pH <6.0時,使用25 mM乙酸鈉緩衝液。在pH 6.0下,使用8.3 mM檸檬酸三鈉緩衝液。在pH> 6.0時,使用12.5 mM磷酸氫二鈉緩衝液。黃色正方形表示典型CEX負載條件下的操作空間,實心符號表示本研究中進行的色譜柱實驗的CEX負載條件。綠色方塊代表典型的CEX洗脫條件的操作空間,空心符號代表在柱實驗中使用的CEX洗脫條件。

3.2 結合洗脫CEX操作中的聚集體形成

Capto SP ImpRes具有連接到瓊脂糖基珠上的磺丙基配體,Fractogel EMD SE Hicap具有連接到聚甲基丙烯酸酯基珠上的觸手狀的磺乙基配體,而POROS XS具有連接到聚苯乙烯二乙烯基苯基珠上的磺丙基配體。爲了比較不同條件下聚集體形成的相對大小,繪製了洗脫液HMW%與上樣HMW%的比率(稱爲「洗脫液HMW%/上樣HMW%的比率」或「聚集物形成比率」)作爲Tm的函數圖2中的DSF(未結合)。對於每種CEX樹脂,觀察到聚集體形成率與Tm DSF(未結合)之間呈反線性關係。爲了使pH值影響與鹽濃度的影響脫鉤,將測試的CEX上樣條件按pH條件進行分組(在圖2中用虛線矩形突出顯示)。結果表明,上樣pH對聚集體形成率有重大影響。對於POROS XS,在上樣條件下在pH 4.5-6.0內增加一個pH單位會導致聚集體形成比率降低2.0到2.3倍。另一方面,如圖2所示,在不同的鹽水平下(40-50 mM與0-10 mM氯化鈉)觀察到兩條基本平行的回歸線。在較低的pH值下,鹽的作用更爲顯著,這對應於較低的POROS XS的Tm DSF(未結合)值,以及CEX上樣中的40-50 mM氯化鈉(vs. 0-10 mM)導致兩種mAb的CEX洗脫液中的HMW含量進一步降低。對於Fractogel EMD SE Hicap和Capot SP ImpRes,鹽水平對mAb1聚集體形成幾乎沒有影響(圖2A),但是,其對mAb2聚集體形成的影響更爲明顯,最大減少了0.5到1.0倍在40-50 mM氯化鈉中的生成比(圖2B)。可以通過以下事實來解釋此行爲:mAb2(IgG4)的總體結構穩定性低於mAb1(IgG1)(圖1)。因此,在Fractogel EMD SE Hicap和Capot SP ImpRes上,鹽水平對mAb2聚集體形成的影響相對於mAb1更爲顯著。總體而言,提高CEX上樣材料的pH和/或鹽濃度通常有利於減輕聚集體的形成,並且對POROS XS特別有效。此外,對於三種CEX樹脂,mAb1(IgG1)和mAb2(IgG4)之間的聚集體形成模式相似,其中POROS XS對上樣溶液條件的依賴性強於Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes。結果還表明,溶液,固定相和蛋白質特性均在不同程度上促成CEX操作中觀察到的mAb聚集,並且固有的mAb特性(例如IgG類型和pI)在表徵範圍內發揮的作用相對較小

圖2. CEX實驗中mAb聚集體的形成與游離溶液中mAb熔解溫度的關係。柱實驗的mAb1(A)和mAb2(B)洗脫液用於HMW分析。POROS XS,Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes的運行結果分別以圓形,正方形和三角形符號顯示。實心(帶有實線回歸線)和空心(帶有虛線回歸線)符號分別表示負載材料中的0-10 mM和40-50 mM氯化鈉。使用虛線矩形按pH對條件進行分組。誤差棒代表重複測量的標準偏差。用於CEX上樣和DSF測量的所有緩衝液還包含20 mM乙酸鈉,pH 5.0。

3.3 結合的mAb分子的結構穩定性

表面蛋白質的吸收對蛋白質結構穩定性有複雜的影響。在這項工作中,在CEX樹脂存在下,通過DSC測量確定結合的mAb分子的Tm值。在DSC實驗中,目標分子的熱信號可以穿透樹脂相,而不受環境因素的干擾最小。使用量熱法測量,DSC克服了DSF的缺點,在DSF中,很難將可歸因於mAb結構變化的螢光信號與樹脂的螢光背景區分開,特別是對於POROS XS。如表1所示,mAb1(從6.2到6.6℃)和mAb2(從4.5到6.5℃)的ΔTmDSC(無界負結合)值均爲正。結果表明,在相同的pH和鹽濃度下,結合的mAb分子的結構穩定性要低於游離溶液中的結合穩定性。對於這種觀察到的模式的解釋與帶正電荷的貼片的異質mAb表面分布有關。圖2中獲得的聚集體形成比率繪製爲圖3中Tm DSC(束縛)的函數。觀察到的負相關表明,CEX上的產物聚集傾向可能歸因於樹脂結合對mAb結構穩定性的影響。吸附對所研究樹脂的mAb結構穩定性的影響遵循以下規律:以遞減的順序POROS XS> Fractogel EMD SE Hicap> Capto SP ImpRes。

圖3. CEX實驗中mAb聚集物的形成與Tm DSC的關係(束縛)。在20 mM乙酸鈉,pH 5.0緩衝液中以結合狀態(與樹脂)測量mAb1(A)和mAb2(B)的Tm DSC值。使用20 mM乙酸鈉,pH 5.0緩衝液運行的POROS XS,Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes的結果分別用圓圈,正方形和三角形符號顯示,並帶有回歸線和方程式。垂直和水平誤差條表示重複測量的標準偏差。

3.4 線性梯度洗脫中的mAb保留

總體mAb/樹脂相互作用取決於固有的分子特性(圖2),溶液條件(圖2)和樹脂特性(圖3)。如圖4所示,洗脫鹽濃度(mAb1爲400-550 mM,mAb2爲450 -600 mM)顯示出一致的模式(POROS XS> Fractogel EMD SE Hicap> Capto SP ImpRes),與CEX運行的聚集形成比率如圖2所示。這證實了在許多因素中,總體mAb/樹脂相互作用對CEX操作中觀察到的產物聚集水平有重要影響。

圖4. CEX實驗中mAb聚集物的形成與線性梯度保留的關係。在pH值爲5.0的10 CV中,使用從0到1 M氯化鈉的線性梯度洗脫mAb1(A)和mAb2(B)。洗脫鹽濃度(mM)基於洗脫峯的一階矩分析。POROS XS,Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes運行的結果分別以圓形,正方形和三角形符號顯示,並帶有回歸線和方程式。誤差線代表重複測量的標準偏差。

3.5 CEX樹脂的疏水性表徵

在這項工作中,使用不帶電荷的疏水性感應螢光染料BODIPY FL和金顆粒的惰性球體GNP開發了表徵方法(請參見材料和方法部分),以定量與mAb色譜行爲相關的樹脂疏水性。由於所用的GNP直徑爲15 nm,與典型mAb的大小相似(流體力學直徑約爲10 nm),因此認爲GNP可及的樹脂疏水性在很大程度上代表了mAb可及的疏水性。使用這種GNP BODIPY方法獲得的CEX疏水性的定量排名(POROS XS >> Fractogel EMD SE Hicap> Capto SP ImpRes)與我們先前研究中CEX樹脂的定性疏水性排名非常吻合,其中POROS XS也顯示出比兩種瓊脂糖基樹脂SP Sepharose FF和CM Sepharose FF疏水性高得多。爲了檢查樹脂疏水性對產品聚集的影響,將圖2中獲得的聚集體形成比率繪製爲BODIPY螢光強度的函數(對數標度),對這些樹脂觀察到正相關關係,如圖5所示。結果表明,mAb可及的樹脂疏水區域可能是CEX操作過程中產物聚集的關鍵因素。與線性梯度保留數據(圖4)相比,樹脂疏水性測量似乎可以清楚地區分POROS XS和Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes。即使在相同的色譜柱操作條件下,POROS XS的表面疏水性也明顯較高,這可能爲其洗脫液爲何比其他兩種樹脂具有更高的HMW水平提供了合理的解釋。綜上所述,對於常見的CEX上樣條件(即pH 4.5-5.5),總體mAb/樹脂相互作用和固有的樹脂疏水性的共同貢獻最終決定了結合的mAb分子結構變化的嚴重性,因此, CEX操作中聚集體的形成程度。

圖5. CEX實驗中mAb聚集體的形成與整體樹脂疏水性的關係。通過使用20 mM乙酸鈉,pH 5.5緩衝液的GNP-BODIPY測定法測量三種樹脂的總體疏水性,X軸顯示的是BODIPY螢光強度。使用20 mM乙酸鈉,pH 5.0緩衝液的POROS XS,Fractogel EMD SE Hicap和Capto SP ImpRes的運行結果分別用圓圈,正方形和三角形符號顯示,並帶有回歸線和方程式。垂直和水平誤差條表示重複測量的標準偏差。

3.6 結合洗脫CEX中的聚集機制

根據上面提供的數據,提出了結合洗脫CEX步驟中mAb聚集體形成的機理(也如圖6所示):1)在CEX上樣準備階段,將上樣材料調整爲酸性條件使mAb分子正確帶電並準備進行柱結合。酸性pH條件會引起局部構象變化,從而減弱mAb的結構穩定性,這種變化也受上樣中鹽濃度的影響。但是,在所檢查的條件下,pH對mAb結構穩定性的影響比鹽濃度的影響更爲顯著。在上樣材料(不含樹脂)中,由於強分子間靜電斥力,部分展開的mAb物種保持單體狀態(圖6中呈黃色的mAb)。一旦pH升高至中性或弱鹼性條件(圖6中爲白色的mAb)(如圖1中pH依賴的Tm值所示),由於酸性上樣調節而導致的mAb結構的部分展開是可逆的。2)在CEX加載階段,帶正電的總體mAb主要通過靜電相互作用與帶負電的樹脂結合,從而導致mAb的結構穩定性進一步降低(圖6中橙色的mAb),而樹脂的衝擊來自從高到低按照POROS XS> Fractogel EMD SE Hicap> Capto SP ImpRes的順序進行。吸附後三種樹脂上mAb的結構穩定性降低(圖3),表明靜電mAb/樹脂相互作用起著關鍵作用,這很可能是由於單個mAb分子上與多個配體相互作用的異質分布的正片。但是,結合的mAb分子的部分解開並不一定會導致產物聚集,因爲即使在明顯的∆Tm DSC(未結合的負離子結合)(兩種mAb均爲4.5-6.2℃)下,在Capto SP ImpRes洗脫液中也觀察到極少的聚集體形成。相反,在Fractogel EMD SE Hicap和POROS XS上結合的mAb分子表現出對不帶電樹脂性能,疏水性有明顯影響的行爲,在這種情況下,很可能是通過與部分暴露的基礎基質和/或可及的配體相互作用而實現的具有疏水成分的接頭。與HIC和反相樹脂不同,CEX樹脂可通過靜電和疏水相互作用的結合而導致mAb部分展開。因此,不帶電的樹脂性能對於進一步弱化結合的mAb分子的結構穩定性至關重要(圖6中爲深棕色)。

3)在CEX洗脫過程中,在結合狀態下發生的具有更重大結構變化的解吸mAb分子更可能形成產物聚集體。Capto SP ImpRes洗脫液中的mAb物種能夠恢復天然結構並導致最低的HMW水平。相比之下,預計Fractogel EMD SE Hicap和POROS XS洗脫液中的mAb物種在結合狀態下會經歷更大程度的結構變化,因此會產生更高的HMW水平(圖6中深棕色的mAb簇)。在這兩種樹脂之間,POROS XS由於整體上較高的樹脂疏水性而具有更明顯的趨勢。應該注意的是,圖6中mAb聚集的示意圖僅用於說明目的,並不意味著暗示特定的聚集機制。

圖6. CEX操作中建議的mAb聚集體形成機理。mAb分子的結構穩定性分爲三個階段:在CEX上樣溶液中,在CEX樹脂表面上以及在CEX洗脫液中。白色,黃色,橙色和深棕色抗體結構分別代表天然mAb,在酸性溶液中部分未摺疊的mAb,吸附後部分未摺疊的mAb和在疏水應力下進一步未摺疊的mAb。簇狀深棕色抗體結構代表洗脫物中聚集的mAb。

4 結論

在這項工作中,研究了溶液條件對兩種治療性單克隆抗體(IgG1和IgG4)的結構穩定性的影響,結果表明在所研究的條件下pH的主要作用。從游離mAb溶液到結合態的Tm值降低表明,CEX樹脂結合可導致兩種mAb的結構穩定性進一步降低。結合的單克隆抗體的結構穩定性按照POROS XS

參考文獻:Huang,C.,Wang,Y.,Xu,X.,Mills,J.,Jin,W.,Ghose,S.,&Li,ZJ(2020)。 陽離子交換樹脂的疏水性影響單克隆抗體的聚集。 色度2020。